Nederlandske forskere kombinerer CRISPR og bioluminescens i en eksperimentell test forSmittsomme sykdommer

Et nyutviklet nattaktivt protein kan fremskynde og forenkle diagnosen av virussykdommer, ifølge forskere i Nederland.
Studien deres, publisert onsdag i ACS Publications, beskriver en sensitiv, ett-trinns metode for raskt å analysere virale nukleinsyrer og deres utseende ved å bruke glødende lyse blå eller grønne proteiner.
Identifisering av patogener ved å oppdage deres nukleinsyrefingeravtrykk er en nøkkelstrategi innen klinisk diagnostikk, biomedisinsk forskning og overvåking av mat- og miljøsikkerhet.De mye brukte kvantitative polymerasekjedereaksjonstestene (PCR) er svært sensitive, men krever sofistikert prøveforberedelse eller tolkning av resultater, noe som gjør dem upraktiske for enkelte helsetjenester eller ressursbegrensede innstillinger.
Denne gruppen fra Nederland er et resultat av et samarbeid mellom forskere fra universiteter og sykehus for å utvikle en rask, bærbar og brukervennlig nukleinsyrediagnosemetode som kan brukes i en rekke settinger.
De ble inspirert av ildflueglimt, ildflueglød og bittesmå stjerner av akvatisk planteplankton, alt drevet av et fenomen kalt bioluminescens.Denne glød-i-mørke-effekten er forårsaket av en kjemisk reaksjon som involverer luciferaseproteinet.Forskerne inkorporerte luciferaseproteiner i sensorer som sender ut lys for å lette observasjon når de finner et mål.Selv om dette gjør disse sensorene ideelle for behandlingspunktdeteksjon, mangler de for øyeblikket den høye følsomheten som trengs for kliniske diagnostiske tester.Mens CRISPR-genredigeringsmetoden kan gi denne muligheten, krever den mange trinn og ekstra spesialisert utstyr for å oppdage det svake signalet som kan være tilstede i komplekse, støyende prøver.
Forskere har funnet en måte å kombinere et CRISPR-relatert protein med et bioluminescerende signal som kan oppdages med et enkelt digitalkamera.For å sikre at det var nok RNA- eller DNA-prøve for analyse, utførte forskerne rekombinasepolymerase-amplifikasjon (RPA), en enkel teknikk som opererer ved en konstant temperatur på rundt 100 °F.De utviklet en ny plattform kalt Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), der de to CRISPR/Cas9-proteinene er spesifikke for ulike sammenhengende deler av det virale genomet, hver med et unikt luciferasefragment festet til seg ovenfor.
Når det spesifikke virale genomet etterforskerne undersøker er tilstede, binder to CRISPR/Cas9-proteiner seg til målnukleinsyresekvensen;de blir i umiddelbar nærhet, slik at intakt luciferaseprotein kan dannes og sende ut blått lys i nærvær av et kjemisk substrat..For å gjøre rede for substratet som ble konsumert i denne prosessen, brukte forskerne en kontrollreaksjon som sendte ut grønt lys.Et rør som endrer farge fra grønt til blått indikerer et positivt resultat.
Forskerne testet plattformen deres ved å utvikle RPA-LUNAS-analysen, som oppdagerSARS-CoV-2 RNAuten kjedelig RNA-isolering, og demonstrerte sin diagnostiske ytelse på nasofaryngeale vattpinneprøver fraCOVID-19pasienter.RPA-LUNAS påviste SARS-CoV-2 med suksess innen 20 minutter i prøver med en RNA-viral belastning så lav som 200 kopier/μL.
Forskerne mener analysen deres enkelt og effektivt kan oppdage mange andre virus."RPA-LUNAS er attraktivt for testing av infeksjonssykdom på punktet," skrev de.